盡管單次使用已非全新的理念，并且在囊式過濾器和貯存袋之類的產品中已經成為標準操作，當下單次使用工藝比常規的生產方法更為復雜，由集成模塊構成——尤其是在新設備中——通常替代了原來的不銹鋼設備。 

目前單次使用技術被*是可以減少交叉污染的風險，降低投資風險，具備更大的靈活性，可以為試驗用藥品提供具有成本效益的產品開發方案。單次使用生物反應器問世尚未超過20 年，考慮到諸如此類的因素，可以認為這種技術在如此短的時間之內呈現出迅猛發展，推陳出新的發展態勢。 

當前，得益于單克隆抗體（mAb）生產領域中菌株的優化和培養基的改善，分批補料式哺乳動物細胞培養系統的生產效率已經顯著提升。生物量濃度已經從1-3 g/L 增至7-10 g/L，因此促進了較小規模的生產容器的運用，不過與此同時，也讓下游的工藝面臨更多的難題。[1,2] 產量更大、濃度更高，深層過濾器難以進行處理。對大于500 L 的體積，要降低生產成本并減少浪費，離心機的使用*。 

運用即用型澄清系統，高達2,000L 的體積都可實現單次使用處理，這樣商業可行的方案，在一個步驟內就能替代離心機和深層過濾器。

收集技術 

高產品滴度源自于細胞密度的增加而非每一種細胞單位生產率的提升，所以固體量會明顯增大，常規的收集技術難以應對。 

目前，zui廣泛應用的單次使用收集技術是深層過濾。不過，生物量濃度較高的情況下，深層過濾器在負載量較低時就會堵塞。較高的污染物濃度也讓深層過濾器對批次變異更為敏感，因此為了彌補過濾能力的波動， 過濾器的面積會過大（ 多達50%）。目前可以使用離心之類的單次使用細胞去除方案，但是生產能力較低，導致成本較高，浪費較大。 

不過，一種新替代方案已經出現。賽多利斯斯泰迪生物技術公司的產品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術，用于高細胞密度的動物細胞培養的收集。這種即用型的澄清系統得益于血漿成分分離行業的啟發，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎，該系統性能穩定、易于使用、快速、可以靈活地放大。 

該系統可以處理高達2,000 L 的體積，因此能夠在一個步驟之內同時替代離心機和深層過濾器。關鍵因素在于進料流中添加了高孔隙度的助濾劑，增加了濾餅的滲透性，防止過濾器出現堵塞。

摻漿過濾 

很長時間以來， 摻漿過濾中運用硅藻土（DE）之類的助濾劑來提升過濾器的性能。[3] 硅藻土（DE， 或稱為diatomite 、kieselgur/kieselguhr） 是一種天然存在的硅質沉積巖，質軟，通常粒徑為10-200 μm。DE 是由硅藻（微小的單細胞藻類）化石的殼或外骨骼構成，具有高孔隙率的結構和惰性特征，通常在生物技術行業的收集階段用于深層過濾器。加入到細胞培養基中的DE 具有雙重作用：濾除亞微米的顆粒，并形成一個具有滲透性的濾餅，改善過濾器的處理量。這種細小的助濾劑顆粒形成無數微小通道，懸浮的雜質被截留，而澄清的液體可以不受阻礙地通過。 

BFF 的工作原理 

現在有眾多產品的生產運用了BFF 系統，其中包括靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）、白蛋白和一些凝血因子，所基于的原理包括選擇性pH 誘導沉淀、離子強度、添加乙醇以及溫度的變化。[4-6] 沉淀物的去除采用的是DE 強化的深層過濾。 

實際操作過程中，需要進行澄清操作的生物工藝流體中固體的濃度過高時，流體將不能透過過濾器表面的濾餅（圖1）。添加DE 之類的助濾劑之后，形成的濾餅更具滲透性，可以防止堵塞。所需DE 的量取決于顆粒的濃度。為了獲得理想的結果并使用盡可能少的DE，建議對細胞培養液進行預處理?？梢蕴砑幽蹌┗蛘呖梢越档蚿H 值，從而形成聚集體，其體積大至不能進入濾餅層。這樣，濾餅可以保持滲透性，而DE 與生物量的比例可以降低為1:4。

 
賽多利斯斯泰迪生物技術公司的產品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術，用于高細胞密度的哺乳動物細胞的收集，該技術得益于血漿成分分離行業的啟發，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎。（圖片有賽多利斯公司提供）圖1：加入硅藻土（左）的動態摻漿過濾和常規的過濾（右）。

DE 有各種級別，純度和滲透性各異，適合不同的應用，而賽多利斯斯泰迪生物技術公司選擇了Celpure C300 作為哺乳動物細胞培養操作中zui合適的助濾劑。 

Celpure C300 特別針對制藥領域設計，采用生產工藝制造，是一種高純度的DE，具有更出色的操作穩定性。在多種培養基、介質和活力條件下進行的測試發現，的DE 濃度為細胞濕重（WCW）的40-50%，如果pH 降低至5，這一比例還可以減小至20-30%。 

低pH 值沉淀的優勢 

對于微孔過濾和深層過濾之類的細胞去除技術，性能的差異可以歸結于低pH 值水平（pH 4.3-5.5）下較小顆粒的沉降。[4-5] 細胞碎片、DNA 以及宿主細胞蛋白在酸性條件下的溶解性都會降低。6 另外，降低pH 值之后可以形成較大的顆粒，原來在pH 7.0 時存在的亞微顆粒會*消失（圖2）。與此類似，較低的pH 值也有利于BFF 的操作：所測試的細胞培養上清液在酸性條件下時，濾出液比中性條件時更為澄清（未顯示數據）。

 
圖2：三種不同的收集方式（綠色=pH 7.0，紅色=pH 5.0，）下，不含細胞的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞培養上清液的平均粒徑分布。利用Mastersizer 2000（Malvern Instruments 公司）記錄數據。

人們認為，DE 可以捕獲大顆粒（>0.4μm），因此總體的滲透性和過濾能力會降低。通過增加DE 的濃度，有可能改善其性能，截留小顆粒，同時不會喪失所需的濾餅滲透性。另外，雖然大部分抗體在酸性條件下是穩定的，但是有一些抗體可能會出現共沉淀。[5-6] 實驗室的BFF 測試在低pH 值條件時，可以獲得85% 以上的回收率（未顯示數據）。 

實際應用 

細胞培養收集過程中BFF 已經作為一種替代方法得到廣泛應用，因此賽多利斯斯泰迪生物技術公司與RentschlerBiotechnologie 公司合作，評估這種技術作為單次使用技術，替代離心機和深層過濾器的可能性。[7] 測試中采用了600 L 的細胞培養生產過程，對條件進行了優化，評估了BFF 技術的升級放大。 

Sartoclear Dynamics 是專門針對藥品生產過程中哺乳動物細胞培養的澄清操作而設計的產品，利用這種設備在一系列細胞株和培養介質中獲得了測試結果。 

運用高細胞密度的中國倉鼠卵巢（CHO） 細胞分批補料式培養（17.6×106 cells/mL，95% 的活力，1000L），進行了試驗生產測試。[8] zui大的BFF 測試為600 L，pH 5.0（WCW = 8%）。在放大試驗中，在通用型不銹鋼支架中使用了總過濾面積為1.61 m2的七個工藝放大模塊。 

過濾器的過濾盒由兩層聚乙烯過濾板組成，中間為DE 和生物量。600L的收集液中加入Cellpure C300 DE（12kg），預填充DE 袋通過無塵適配器與混合袋連接，迅速安全地轉移DE。溫和混勻5 分鐘之后，DE 的粉末溶于細胞懸浮液中；另外，在過濾前，對所獲得的混合物調節pH 至5.0，以140 rpm 的速度混合2 小時。 

圖3 所示為操作過程中的壓力增加情況。當壓力值達到1.3 bar 時，過濾過程結束，初始收集液已經過濾。在整個過程中保持了大約為300 L/m2/h 的快速且穩定的流速，并且總體的處理能力達到了311L/m2。在過濾過程中，澄清的收集液流具有很低的濁度水平（5–8 NTU）。中和之后，zui終的液體具有41 NTU 的濁度，這個數值相當高，可能的原因在于未能充分調節中和緩沖液的用量。 

在一項小規模的平行測試中，改良中和步驟之后可以防止濁度的增加。正在開發的一種即用型整合工藝模塊，可以讓pH 值的在線調節實現可控。例如，IgG1 的回收率目前為85%（圖3），今后，通過優化中和步驟，改進過濾后沖洗，mAb 的回收率將有望進一步得到提升。在整個工藝過程內對宿主細胞蛋白質和DNA 之類的污染物進行了監控，在zui終的液體內（緩沖液沖洗以及中和之后），這些污染物的濃度分別從841 和13.8 mg/ml 降低至629 和5.0 mg/ml。

 
圖3：七個過濾器模塊中，降低pH（5.0）的情況下DE 摻漿過濾試驗放大的結果。左：過濾性能、壓力（bar）、流量（L/m2）以及過濾過程中的濁度。右：IgG1 的回收，在初始收集液、無緩沖沖洗的收集液（液1）、有緩沖沖洗（液2）以及中和之后的收集液（液3）中進行測量。

實驗結果 

BFF 的試運行試驗證實了此前實驗室中觀察到的結果：DE 加入到初始的細胞培養上清液之后，將pH 降低至5.0，這樣的條件之下在過濾性能、沖洗和污染物去除方面可以獲得的結果。此外，只需運用七個過濾模塊，就可以在1 小時之內對600L 的收集液進行處理。因為模塊座可以容納多達33 個的模塊，可以預計，高達3,000L 的收集體積可以同時進行過濾。因此，運用這樣的方法，在單次使用的大規模裝置內，可以對初始的高密度細胞培養收集液實現的澄清操作。 

總結 

測試的目的是為了證實一種新穎的單次使用收集方法，對于高密度的哺乳動物細胞培養具有普遍的適用性，測試中采用了不同的細胞株和培養條件下的初始收集液，確定了DE 作為助濾劑的濃度。此外，在低pH 條件下，發現助濾劑的量可以減少50%。 

與沉淀過程結合使用時，研究中的單次使用澄清系統穩定可靠，無需再使用離心機，其結果穩定一致，該系統易于操作、快速、可以在線放大，可以將兩步驟的細胞收集操作轉變為的單步驟操作，節約了時間和資金。 

BFF 等類似可以實現放大的技術彌補了單次使用產品市場中zui大的空白之一。當前單次使用生物反應器的標準體積設定為2000 L，如此龐大的體積，不再需要離心機來去除細胞，這對于生物制藥行業而言是巨大的技術進步，構建了一個真正的單次使用過程，帶來了的靈活性，顯著地降低了資金投入。Sartoclear Dynamics 這種產品特別針對cGMP 工藝設計，由單次使用預填充袋組成，其中含有超純級別的硅藻土，可以在0.5-10 kg 的范圍內選擇。無塵粉末轉移裝置配備有快速連接適配器，DE可以直接與細胞培養液混合。這種多孔的助濾劑可以防止過濾器堵塞，另外因為該系統內生物量和助濾劑一直保持穩定的比例，過濾器的性能則可以連續穩定且達到狀態，用戶因此受益。BFF能夠以高流速對非常稠密的初始細胞收集液進行澄清操作，因此具有經濟效益并且提升了生產力。(end)北京富瑞恒創科技有限公司。